Пептиды и запрограммированная гибель клетки (апоптоз): от фундаментальных исследований к практической значимости

Тема презентации: Пептиды и запрограммированная гибель клетки (апоптоз): от фундаментальных исследований к практической значимости.

Спикер: Наталья Сергеевна Линькова — ведущий научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории разработки систем доставки лекарственных препаратов ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» МЗ РФ. Автор более 400 научных публикаций.

Апоптоз (от древнегреческого слова, означающего «листопад») — физиологически запрограммированная гибель клетки. В 1972 г. Джон Керр описал процесс гибели лимфоцитов под действием глюкокортикоидов и назвал его апоптоз. В 2002 г. за исследования апоптоза была присуждена нобелевская премия Сиднею Бреннеру, Роберту Хорвицу и Джону Салстону.

Всегда ли апоптоз — это плохо и какой биологический смысл имеет данное явление? К негативным эффектам апоптоза можно отнести гибель клеток при патологических процессах и в стареющем организме, когда не происходит их замены на достаточное число более «молодых» и функционально активных клеток. К позитивным эффектам апоптоза относят защиту от образования раковых клеток, замену стареющих, функционально неполноценных клеток, на более «молодые» клетки, хорошо выполняющие свои функции.

Апоптоз включает в себя несколько стадий. Сначала клетка получает внутриклеточный или внеклеточный сигнал на запуск апоптоза. К внеклеточным сигналам относятся глюкокортикоидные гормоны, белок фактор некроза опухоли (TNFa) и рецепторы — Fas-лиганды. К внутриклеточным сигналам апоптоза относятся повреждения ДНК, не поддающиеся восстановлению (репарации) и повреждения мембраны клетки. Повреждения ДНК и клеточных мембран могут быть вызваны действием химических ядов, ионизирующим излучением, различными патологическими процессами. В начале развивается сигнальная фаза апоптоза. Она включает в себя рецепторный (внешний) или митохондриальный (внутренний) путь апоптоза. Эти пути приводят к конденсации хроматина, фрагментации ДНК и нарушению структуры митохондрий. Далее наблюдается эффекторная фаза апоптоза — разрушение мембраны клетки. Завершающей становится деградационная фаза — образование апоптотических телец и их уничтожение макрофагами.

Сигналом к началу рецепторного (внешнего) апоптоза может быть гипоксия, воздействие физических или химических факторов, нарушение клеточного цикла при различных заболеваниях и старении. Активацию апоптоза с участием рецепторов клеточной гибели могут осуществлять иммунные клетки. Одним из примеров запуска рецепторного апоптоза является химио- и радиотерапия, направленная на разрушение раковых клеток. Ключевыми молекулами апоптоза являются белки каспазы — 3,-7, −8.

Митохондриальный путь апоптоза реализуется следующим образом. Повреждение ДНК в ядре и митохондриях при воздействии патологических процессов или химических веществ приводит к активации белков р53, р16, р21. Белок p53 активирует белки семейства Bcl-2 — регуляторы проницаемости наружной мембраны митохондрий. После этого из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль (внутрь клетки) высвобождаются цитохром С, прокаспазы-2, −3, −9 и белок AIF (apoptosis inducing factor; фактор, индуцирующий апоптоз). Далее формируется апоптосома, в которой происходит активация каспазы-9. Каспаза-9 активирует каспазу-3 [Дятлова А.С. и др., 2018].

Короткие пептиды, состоящие из 2х, 3х и 4х аминокислотных остатков (Хонлутен, Везуген, Эпиталон, Тимоген) могут взаимодействовать с пусковыми зонами (промоторами) генов апоптоза в ДНК. В результате происходит изменение синтеза матричной РНК (мРНК) и синтеза белков апоптоза. Например, пептиды Хонлутен, Везуген, Эпиталон и Тимоген в культурах клеток разных тканей регулируют синтез белков апоптоза р16, р21, р53, каспаз-8 и −9, AIF.

Хонлутен: регуляция апоптоза и предотвращение заболеваний легких. Было установлено, что трипептид Хонлутен (EDG) снижает синтез белков митохондриального апоптоза в культуре клеток бронхиального эпителия человека при старении. Клетки бронхиального эпителия человека линии FLECH были получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки выращивали до 3 пассажа («молодые» клетки) и до 14 пассажа («старые» клетки). Все культуры разделяли на 2 группы: контроль и добавление пептида в концентрации 100 нг/мл. Методом иммуноцитохимии в клетках оценивали площадь экспрессии (синтеза) белков митохондриального апоптоза — AIF и каспазы-9. При старении клеток бронхиального эпителия человека в них в 2 раза возрастал синтез каспазы-9 и более, чем в 10 раз, синтез AIF. Хонлутен снижал синтез каспазы-9 в «старых» клетках легких человека на 57% и AIF — в 2 раза [Дудков А.В., 2019].

Как же взаимосвязано снижение выраженности апоптоза в клетках легких и бронхопротекторные эффекты этого трипептида? Старение ткани легких (аналогично старению клеток в культуре) характеризуется повышением в эпителиоцитах синтеза проапоптотических белков — каспазы-9 и AIF. Хонлутен снижает синтез этих белков, предотвращая апоптоз клеток легких. Курение приводит к активации митохондриального апоптоза в ткани легких и развитию различной легочной патологии [Künzi L. et al., 2019]. Хонлутен, снижая синтез белка апоптоза AIF, предотвращает развитие заболеваний легких. Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) на молекулярном уровне характеризуется повышенным синтезом каспаз [Pandey K.C. et al., 2017]. Хонлутен, снижая синтез каспазы-9, способствует предотвращению развития ХОБЛ.

Везуген: регуляция апоптоза и предотвращение заболеваний сосудов. Вазопротекторный трипептид Везуген (KED) снижал синтез белков апоптоза в культуре клеток сосудов (эндотелиоцитов) крысы при старении. Клетки выращивали до 3 пассажа («молодые» клетки) и до 14 пассажа («старые» клетки). Все культуры разделяли на 2 группы: контроль и добавление пептида в концентрации 100 нг/мл. Методом иммуноцитохимии в клетках оценивали площадь экспрессии белков апоптоза — р16, р21 и р53. При старении клеток эндотелия сосудов в культуре площадь экспрессии белков р16, р21 и р53 возрастала в 1,3-3,5 раза. Пептид KED снижал синтез этих белков практически до уровня «молодых» культур клеток [Дудков А.В., 2019].

Как же взаимосвязано снижение выраженности апоптоза в клетках сосудов и вазопротекторные эффекты этого трипептида? Известно, что синтез белков апоптоза р16, р21 и р53 повышается при ускоренном старении клеток сосудов. Это может приводить к развитию атеросклероза и других заболеваний сосудов. Пептид KED снижает синтез белков апоптоза. В связи с этим пептид KED можно применять для профилактики развития атеросклероза и его последствий — ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда [Khavinson V. et al., 2023].

В статьях К.В. Китачева и соавторов приведены данные успешного клинического применения Везугена в капсулах у 41 мужчины в возрасте 65-80 лет с ишемией нижних конечностей и эректильной дисфункцией. Эти заболевания могут возникать вследствие апоптоза эндотелиоцитов сосудов. Снижение апоптоза эндотелиоцитов под действием пептида KED является молекулярным механизмом его вазопротекторного действия при заболеваниях сосудов [Китачев К.В. и др., 2013; 2014].

Эндолутен: регуляция апоптоза и предотвращение старения кожи. Полипептидный комплекс эпифиза Эндолутен и входящий в его состав тетрапептид Эпиталон (AEDG) снижали синтез белка апоптоза р53 в культуре дермальных (кожных) фибробластов крысы при старении. Клетки выращивали до 3 пассажа («молодые» клетки) и до 14 пассажа («старые» клетки). Все культуры разделяли на 3 группы: контроль, добавление пептида AEDG в концентрации 100 нг/мл и добавление Эндолутена в концентрации 1000 нг/мл. Методом иммуноцитохимии в клетках оценивали площадь экспрессии белка р53. При старении дермальных фибробластов в культуре площадь экспрессии белка р53 возрастала в 18,3 раза. Пептид AEDG и Эндолутен снижали синтез белка р53 в фибробластах кожи соответственно в 3,8 и 8,4 раза. Эндолутен снижал синтез проапоптотического белка в «старых» клетках до уровня, характерного для «молодых» культур. Более выраженный эффект Эндолутена по сравнению с пептидом AEDG связан с тем, что в его составе кроме пептида AEDG содержится большое количество других коротких пептидов и аминокислот [Линькова Н.С. и др., 2016].

Как же взаимосвязано снижение выраженности апоптоза в клетках кожи и протекторные эффекты Эндолутена? По данным клинического исследования у 30 женщин среднего и пожилого возраста применение Эндолутена в капсулах в сочетании с трипептидами способствовало повышению толщины эпидермиса и дермы и улучшению внешнего вида кожи [Фридман Н.В. и др., 2020; 2021]. Этот эффект Эндолутена объясняется снижением апоптоза фибробластов дермы (один из слоев кожи) при их старении, выявленном в экспериментах на культурах клеток. Таким образом, применение полипептидного комплекса эпифиза (Эндолутен в капсулах или крема серии Revilab evolution) будет предотвращать возрастные изменения кожи.

Владоникс: регуляция апоптоза и нормализация иммунитета. Установлено, что пептид EW (лекарственный препарат Тимоген), входящий в состав полипептидного комплекса тимуса Владоникса, снижает синтез белков апоптоза в лимфоцитах крови человека при старении. Лимфоциты выращивали до 3 пассажа («молодые» клетки) и до 14 пассажа («старые» клетки). Все культуры разделяли на 2 группы: контроль и добавление пептида в концентрации 100 нг/мл. Методом иммуноцитохимии в клетках оценивали площадь экспрессии белков апоптоза — р16, р21, р53 и каспазы-8. При старении лимфоцитов крови в культуре площадь экспрессии белков р16, р21, р53 и каспазы-8 возрастала в 4-10 раз. Пептид EW снижал синтез этих белков в «старых» лимфоцитах крови в 1,4 — 3 раза [Дудков А.В., 2019].

Владоникс применяется при вирусных, бактериальных инфекциях, после курсов хими- и лучевой терапии у онкологических больных, при ускоренном старении иммунной системы. Активным компонентом Владоникса является лекарственный препарат Тимоген, дипептид EW. Поскольку пептид EW в составе Владоникса снижает синтез белков апоптоза в лимфоцитах крови при их старении, можно заключить, что этот механизм лежит в основе иммунопротекторного действия данного полипептидного комплекса.

Заключение

• Апоптоз — это запрограммированная гибель клетки в ответ на ее старение или повреждение, вызванное патологическим процессом. Короткие пептиды путем взаимодействия с промоторными (пусковыми) зонами генов регулируют синтез белков апоптоза. Пептидная регуляция апоптоза — один из важнейших механизмов эффективности пептидных биорегуляторов.
• Хонлутен (пептид EDG) снижает синтез белков апоптоза (каспазы-9 и AIF) в клетках легких. Это объясняет эффективность Хонлутена в профилактике и лечении хронической обструктивной болезни легких.
• Везуген (пептид KED) снижает синтез белков апоптоза (p16, p21, p53) в эндотелиоцитах сосудов. Это объясняет эффективность Везугена в профилактике и лечении атеросклероза.
• Эндолутен (полипептидный комплекс эпифиза) и его активный компонент пептид AEDG снижают синтез белка апоптоза p53 в фибробластах кожи. Это объясняет эффективность применения Эндолутена в форме капсул и в составе косметики для замедления старения и улучшения внешнего вида кожи.
• Владоникс (полипептидный комплекс тимуса) и его активный компонент, пептид EW, снижают синтез белков апоптоза (p16, p21, p53, каспазы-8) в лимфоцитах крови. Это объясняет эффективность применения Владоникса при инфекционных заболеваниях.

Практические рекомендации

Литература

1. Дудков А.В. Пептидная регуляция каспаза-зависимого апоптоза при клеточном старении. Современные проблемы науки и образования. 2019; 2: 1-11.
   http://www.science-education.ru/article/view?id=28701
2. Дятлова А.С., Дудков А.В., Линькова Н.С., Хавинсон В.Х. Молекулярные маркеры каспаза-зависимого и митохондриального апоптоза: роль в развитии патологии и процессах клеточного старения. Успехи современной биологии. 2018; 138(2): 126-137.
   https://khavinson.info/assets/files/russ/2018-diatlova.pdf?ysclid=lr3wbpvr8o386349119
3. Китачев К.В., Сазонов А.Д., Козлов К.Л., Петров К.Ю, Слюсарев А.С., Седова Е.В. Роль вазоактивного пептида в лечении хронической артериальной недостаточности нижних конечностей. Успехи геронтологии. 2013; 26(2): 292-296.
   http://www.gersociety.ru/netcat_files/userfiles/10/AG_2013-26-02.pdf
4. Китачев К.В., Сазонов А.Д., Козлов К.Л., Петров К.Ю, Слюсарев А.С., Хавинсон В.Х. Эффективность пептидного биорегулятора сосудов в комплексной терапии васкулогенной эректильной дисфункции у лиц пожилого и старческого возраста. Успехи геронтологии. 2014; 27(1): 156-159.
   https://peptides1.ru/press_center/artikles/the_effectiveness_of_a_peptide_bioregulator_of_blood_vessels/?ysclid=lr3w2mag4v634984874
5. Линькова Н.С., Дробинцева А.О., Орлова О.А., Кузнецова Е.П., Полякова В.О., Кветной И.М., Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция функций фибробластов кожи при их старении in vitro. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2016; 1: 40-44.
   https://khavinson.info/assets/files/skan/2016-linkova_drobinceva.pdf?ysclid=lr3w02i5m3894405493
6. Фридман Н.В., Линькова Н.С., Бойко Л.В., Кахели М.А. Влияние пептидных биорегуляторов на структурно-функциональные особенности кожи лица женщин пожилого возраста. Молекулярная медицина. 2021; 4: 42-46.
   https://artmediaclinic.ru/stati/vliyanie-peptidnyh-bioregulyatorov-na-strukturno-funktsionalnye-osobennosti-kozhi-litsa-zhenshhin-pozhilogo-vozrasta/
7. Фридман Н.В., Бойко Л.В., Трофимова С.В. Перспективы применения пептидных биорегуляторов для восстановления структуры кожи женщин среднего возраста. Врач. 2020; 31(9): 62–66.
   https://artmediaclinic.ru/stati/perspektivy-primeneniya-peptidnyh-bioregulyatorov-dlya-vosstanovleniya-struktury-kozhi-zhenshhin-srednego-vozrasta/?ysclid=lraahqw04821476076
8. Khavinson V., Linkova N., Dyatlova A., Kantemirova R., Kozlov K. Senescence-Associated Secretory Phenotype of Cardiovascular System Cells and Inflammaging: Perspectives of Peptide Regulation. Cells. 2023. Vol. 12. 106. 22p.
   https://doi.org/10.3390/cells12010106
9. Künzi L., Holt G.E. Cigarette smoke activates the parthanatos pathway of cell death in human bronchial epithelial cells. Cell Death Discov. 2019. 5:127.
   https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31396404/
10. Pandey K.C., De S., Mishra P.K. Role of Proteases in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Front. Pharmacol. 2017. 8: 512.
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28848433/